Korean, Edit

使用 Seurat 确定细胞类型

推荐文章： 【生物信息学】【生物信息学分析目录】(https://jb243.github.io/pages/836)

1. 官方教程

2. 定制

3. 故障排除

a. 细胞类型分类管道

b. 通过分散确定细胞类型

c. 使用scanpy确定细胞类型

※ 本文档是最近升级到 Seurat v5.0 之前的文档。

※ 修拉是以乔治·修拉的名字命名的。


1.官方教程（R STUDIO）


受保护_0

图片

图。 1. 基于 DimPlot 表示的细胞类型的聚类


⑴ 示例文件

⑵ scRNA-seq数据表示reads计数除以总转录本再乘以10,000

⑶创建SeuratObject

① min.features : 值越小，缺失数据越少

⑷ 使用_FindVariableFeatures_函数中的nfeatures参数选择表达量最高的前2000个基因

① nfeatures : 值越大，聚类效果越好。一般来说，拥有超过 2,000 个特征不会对聚类产生显着影响

⑸标准化数据

① scRNA-seq 数据使用对数标准化进行缩放

② 随后，通过细胞总读取计数和线粒体读取计数的回归将数据缩放为 z 分数

⑹比例数据

① pbmc@assays$RNA@scale.data 是从 pbmc@assays$RNA@data 创建的

② 操作1：调整pbmc@assays$RNA@data中存储的归一化表达的零点

○ pbmc@assays$RNA@scale.data 的最小值通常为负数

③ 操作2：缩放后超过10的值设置为10

○ 如果没有此分配操作，pbmc@assays$RNA@data 和 pbmc@assays$RNA@scale.data 之间的 Spearman 相关性将为 1：保留等级

④ 通过pbmc@assays$RNA@scale.data可以更好地观察真实的基因表达

○ TCGA（癌症基因组图谱）等bulk-RNA seq中常用的0-10标度被推断为基于scale.data

⑺运行PCA

①进行PCA（主成分分析）进行降维：提高聚类效率

② 利用50个主成分进行聚类

⑻杰克斯特劳

① 参考指南中指定的参数如果给出则可以省略

② num.replicate : 值为1不影响后续步骤

⑼ScoreJackStraw

① 参考指南中指定的参数如果给出则可以省略

⑽ 通过_FindClusters_进行聚类，通常分辨率为0.5

① 分辨率 ： 值越大，细胞类型的分类越多样化

② FindClusters 采用基于图的方法

⑾运行UMAP

① 变暗 : 可以稍微改变地图的形状

⑿ Wilcoxon 秩和检验用于_FindAllMarkers_

① 标记基因需要在簇内超过 25% 的细胞中表达，并且倍数变化大于 0.25（对数刻度）

⒀ 点图

① 链接

② 虽然上面的代码中没有显示，但是这个是经常使用的

⒁ 特征图

① 链接

② 虽然上面的代码中没有显示，但是这个是经常使用的



2.定制

⑴ 概述：如果你想用Seurat分析自己的数据

⑵ 在filtered_gene_bc_matrices/hg19/目录下，有三个文件> ① barcodes.tsv : 每个单元的条形码

② genes.tsv : 人类基因的正式名称和别名

③ matrix.mtx : 表示每个条形码和基因的基因表达的稀疏矩阵

⑶ 第一第一。修改矩阵.mtx

① 1st - 仅包含 1st 的矩阵 - 将给出 1st 数据（带有行名和列名）

② 1st - 2nd - 将第一个值指定为matrix.mtx中数据指示的非零基因的位置

③ 1st - 3rd - 将第二个值指定为非零数据指示的单个单元格的条形码

④ 1st - 4th - 将第三个值指定为非零数据指示的表达水平

⑤ 1st - 5th - 将第一、第二、第三个值组合成一行，构造整个矩阵（稀疏矩阵结构）

⑥ 1st - 6th - 将整个矩阵保存为文本文件并将其转换为 .mtx 文件

⑦ 1st - 7th - 替换原来的matrix.mtx文件，添加前三行如下


图片

图。 2.矩阵.mtx的格式


%%MatrixMarket 矩阵坐标实数通用 % 32738 1047 2572919

○ 32,738 : 人类基因数量，无需改变

○ 1,047为条码数量，需根据实验调整

○ 2,572,919 为非零数据点数，需根据实验进行调整

⑧ 建议阅读matrix.mtx.gz 而不是matrix.mtx

⑷ 第二第二。修改barcodes.tsv : 将条形码随机分配给实验数据中的单细胞数量（不重叠）

① 如果matrix.mtx中的条码顺序超出barcodes.tsv中的条码计数范围，则会显示以下错误消息：

readMM(): 列值 ‘j’ 不在 1:nc 中

② 建议阅读 barcodes.tsv.gz 而不是 barcodes.tsv

⑸ 第三rd。无需修改genes.tsv

① 随着 Seurat 版本的更新，genes.tsv 应重命名为 features.tsv

② 建议阅读 genes.tsv.gz 而不是 genes.tsv



3. 故障排除

⑴“文件太大，无法用记事本打开。”

① 当文本文件开始接近 1 GB 时无法添加内容

② 写字板速度慢且缺乏所需功能

③ 使用 gVim 8.0 (Windows) 或 sublime txt (Mac) 等程序编辑大文本文件

⑵“提供的目录不存在”


受保护_1


① 直接解压文件并更改生成文档的目录地址

② 文件可在各个网站上获取

③修改代码如下


受保护_2


⑶ 条码文件丢失。期待 barcodes.tsv.gz

① 最近的 Seurat 管道需要 barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz 而不是 barcodes.tsv、genes.tsv、matrix.mtx

② 如果处理针对旧 Seurat 版本定制的数据集，请使用 ReadMtx 而不是 Read10X

⑷“错误：loadNamespace(j <- i[[1L]], c(lib.loc, .libPaths()) versionCheck = vI[[j]]) 中‘Seurat’的包或命名空间加载失败：没有名为‘multtest’的包”


受保护_3


⑸ “错误：无法分配大小为 13.3 GB 的向量”

①原因：进程超出内存限制

○ pbmc ← ScaleData(object = pbmc, features = all.genes) 期间通常需要大量内存

○ pbmc ← JackStraw(object = pbmc, num.replicate = 100) 也需要内存，将 num.replicate 改为 1 即可解决» ○ Memory.limit 不能超过 RAM 内存

○ 任务管理器 → 性能 → 内存

○ 检查总内存容量

○ Seurat 一般使用 7 GB，根据数据大小需要额外内存（例如 13.3 GB）

○ 在检查已使用的插槽后购买额外的 RAM 会有所帮助

○（评论）对于数据分析，32 GB RAM 似乎是必要的

② 解决方案（R 4.1.x 版本或更低版本）


受保护_4


③解决方案（R 4.2.x版本或更高版本）

○ “不再支持 memory.limit()”错误

○ 增加 R 的最大内存限制，如下所示（参考）


受保护_5


○ 不过，在R 4.2.x及以上版本，内存会自动增加，所以不用担心([参考](https://community.rstudio.com/t/how-to-increase-the-memory-allocation-after-r-version-4-2/148935#:~ :text=need%20to%20worry%2C-R%20will%20access%20all%20available%20memory%20and%20not%20limit%20本身。,-解决方案））

⑹“错误：在 dimnamesGets(x, value) 中为“dgTMatrix”对象指定的暗名称无效”

① 问题：genes.tsv 中的值排序不正确导致 Read10X 出现问题

② 确保所有元组都在 3 列中，以便顺利进行下一步

⑺ 旧的 seurat 对象 624 个样本中的 23341 个基因

① 问题：旧的 seurat 对象难以分析或观察

② 解决方案：使用UpdateSeuratObject


受保护_6


⑻ 如何从 Seurat 对象保存 matrix.mtx、barcodes.tsv 和 genes.tsv 文件。 (右)


受保护_7


⑼ 当您有 matrix.mtx、barcodes.tsv 和 features.tsv（或 genes.tsv）时创建 h5ad 文件 (Python)


受保护_8


⑽ 当存在包含matrix.mtx.gz、barcodes.tsv、features.tsv的tissue_dir目录以及spatial文件夹时，Python中读取Visium数据的代码


受保护_9


⑾ 如果 matrix.mtx.gz、barcodes.tsv 或 features.tsv 已损坏：

① 如果 matrix.mtx.gz 文件损坏，请在 R 环境中使用 readMM 读取它，并使用 writeMM 恢复损坏的文件。

② 对于barcodes.tsv和features.tsv，在R环境中使用read.table读取它们，并使用write.table恢复损坏的文件。

⑿ 相同的代码可能会根据计算机的不同产生不同或相似的结果

① 原因：初始条件（即种子）可能略有不同。

⒀ 输入文件是 .rds


受保护_10


① .rds 文件：存储R中的单个变量

⒁ 输入文件为 .RData 或 .Rdata


受保护_11


① .RData 文件：存储R中所有变量

⒂ 输入文件为 .RDS 或 .Rds


受保护_12


① .RDS 文件：存储R中所有变量或单个变量

⒃ 输入文件是 .h5

① R : 以下代码读取 .h5 文件作为稀疏矩阵


受保护_13


② Python : 以下代码读取一个 .h5 文件作为 AnnData


受保护_14


⒄ 输入文件是.h5ad

① R : 以下代码将 .h5ad 文件读取到 Anndata 对象中（2023 年 3 月新建立）


受保护_15


② Python : 以下代码将 .h5ad 文件读入 Anndata 对象


受保护_16


③ 将 Seurat 对象 pbmc3k 保存为 h5ad （参考）。


受保护_17


⒅ 输入文件是 .rda


受保护_18


> ① .rda 文件：在 R 中存储单个变量。与 .rds 不同，变量使用加载函数加载，没有返回类型

②注意RStudio中安装了ipynb.rda文件

受保护_19

⒆ 输入文件是 .Rmd

① .ipynb 和 .Rmd 文件是可以相互转换的

② 从 .Rmd 文件创建 .ipynb 文件的代码（参考）

受保护_20

⒇ 输入文件是 .Robj

① 使用 load() 函数可以输入

② 参考

受保护_21

⒇ 输入文件为 .cel (ref1, ref2)

① .cel 文件是 Affymetrix 创建的原始数据文件扩展名

② 代码

受保护_22

○ 上述例子的特点如下

○ 读取单个文件并且只有 1 个样本：但也可以读取文件夹本身

○ 使用名为 HG-U133A 的检测

○ 22283 个特征：特征表示基因，probe_id

○ 基因表达量扩大至 14

⒇ 当源文件为 .ipynb 时

① Jupyter Notebook文件包含记录的代码和执行过程

② .ipynb 文件不仅可以在Python中生成，也可以在R中生成

③ 如何查看内容 : Anaconda、Google Colab、GitHub

⒇ 当源文件为 .Rmd 时

① 将 Rmd 文件转换为 ipynb 文件的软件包

受保护_23


输入： 2019年11月25日 20:22

修改： 2022年12月28日 23:39

results matching ""

    No results matching ""