细胞实验方案第 2 章。细胞实验概述第 2 章
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1. 概述
2. 动物细胞培养类型
3. 细胞固定
4. 细胞培养的历史
1. 概述
⑴ 目的
① 细胞大规模定量培养
② 细胞源物质的量产
○ 来自动物细胞：疫苗、抗体、酶、激素
○ 来自植物细胞：药品、食品添加剂、香料、农药、植物激素、酶
⑵ 动物细胞
① 动物细胞大小：直径10–30 µm
② 动物细胞增殖：倍增时间~10-50小时
③动物细胞废品：铵、乳酸
④ 多为贴壁细胞。
⑶ 术语
① 细胞系：首先开始培养的细胞
② 传代次数：继代培养的次数
○ 干细胞：传代数4-8次为宜
○ 癌细胞：传代次数无限制
③ 世代数：细胞分裂的次数
④ 分流比：继代培养时将培养物分成多少份
⑤ 世代数与传代数的关系
N总数 = 2（代数） × N0 =（分流比）（传代数） × N0
∴ 世代数 = 传代数 × log(分流比) / log(2)
参见log(分流比) / log(2) ≈ (分流比) / 2 (分流比) = 2, 3, 4, 5
∴ 世代数 = 传代数 × (分流比) / 2
⑷因素
① 因素 1. 支持材料
○ 由于大多数细胞都是贴壁的：支持物的表面积与体积之比应该很高。
② 因子 2. 传质
③ 因子2-1.外部环境条件的控制：温度、pH、DO、养分、氧化还原电位、CO2浓度
○温度：37±0.2℃；可接受范围窄，对高温特别敏感。
○ pH：在培养早期趋于上升；随着细胞增殖，乳酸积累，pH 值降低。
○ 溶解氧（DO）
○ 随着新陈代谢的进行，溶解氧会减少。
○ 高溶解氧可能具有细胞毒性
○ DO 低时：吹入氧气
○ 当 DO 高时：用氮气吹扫
○ 营养物质：通过培养基交换持续供给
○ 模式 1. 分批培养
○ 模式 2. 连续培养
○ 曝气：采用最大化氧气转移的曝气方法
④ 因子2-2。最大限度地减少有毒代谢物（如乳酸和铵）的积累。
⑤ 因素 3. 机械刺激
○ 最小化搅拌速度以减少对细胞的机械损伤。
2. 动物细胞培养的类型
⑴液体培养的种类：表面培养、深层（液下）培养、透析培养
⑵ 液体培养、悬浮细胞
① 方法1. 搅拌烧瓶
○ 最小化搅拌速度以减少细胞的剪切应力。
② 方法 2. Biostat
○ 提供新鲜培养基并去除产物以保持恒定的条件。
③ 方法3. 混合和曝气
④ 方法 4. 旋转室
○ 组件 1. 细胞室：细胞聚集的地方
○ 成分 2. 半透膜
○ 组件3. 取样口：细胞产品出口
⑤ 方法5. 中空纤维
⑥ 方法6. 灌流悬浮培养» ○ 定义：细胞被限制在中空纤维周边狭窄隔室中的系统；新鲜培养基被灌注（流过），用过的培养基沿管排出。
○ 优点： 显着提高细胞增殖能力；引起多层化。
⑦ 方法 7. NASA 生物反应器
○ 定义：为细胞生长创造模拟微重力环境的旋转培养物
○ 优点：微重力条件造成的物理损坏最小
○ 当旋转停止时，细胞沉降，允许培养基交换。
⑶ 液体培养、贴壁细胞
① 方法1. Nunc细胞工厂
○ 堆叠式矩形培养皿状单元
② 方法2.烧瓶
○ 缺点：仅利用总表面积的一侧。
③ 方法3. 滚瓶
○ 优点：可以利用几乎整个表面积。
④ 方法4.微载体
○ 定义： 细胞附着在微珠上生长的培养方法。
○ 微珠尺寸：90–300 µm
○ 填充床生物反应器：固定微珠。
○ 流化床生物反应器：微珠处于运动状态。
⑤ 方法5.陶瓷基体
⑥ 方法 6. 多托盘
○ 特征： 通常由 10 个室组成。
⑦ 方法7.塑料薄膜
○ 定义：细胞在薄膜内培养。
○ 薄膜材质：PET-Teflon（氟乙烯丙烯）
⑧ 方法 8. Heli-cell
○ 定义：细胞在螺旋带上培养。
○ 使用聚苯乙烯绞合带作为包装材料。
⑨ 方法 9. 堆叠板
○ 缺点：较高的介质体积与表面积之比。
⑷ 固态培养
① 定义：细胞直接培养在含有适当水分的培养基表面。
② 示例：蘑菇种植、堆肥发酵、发酵豆制品生产
3. 细胞固定
⑴ 定义： 将贴壁细胞固定到位
⑵ 优势
① 促进细胞增殖。
② 稳定性的提高可以实现长期培养。
③ 实现贴壁细胞悬浮培养：增加单位体积表面积；模仿 3D 组织。
④ 防止剪切应力。
⑤ 表面处理可以免除不断添加生长因子的需要。
⑶ 类型1.使用颗粒载体：细胞附着在载体表面进行培养。
①优点：增加表面积；更均匀的生长环境
⑷ 类型2. 微囊化：细胞被包裹在胶囊膜内。
① 胶囊具有明确的截留分子量。
② 优点：防止免疫细胞浸润；防止剪切应力。
③ 缺点：限制溶解氧和营养物质的扩散。
4. 细胞培养的历史
⑴ 19世纪中叶：巴斯德提出微生物发酵。
⑵ 1870年代：科赫提出加热灭菌方法
⑶ 1933年：Kluyver提出使用烧瓶进行悬浮培养。
⑷ 1940年：二战期间采用深层培养方法大规模生产青霉素。
输入：2019.10.07 13:13