①【酵母二杂种测定](https://jb243.github.io/pages/77#:~:text=%E2%91%B4-,%EC%9D%B4%EC%A4%91%EC% 9E%A1%EC%A2%85%EC%B2%B4%EA%B3%84,-%3A%20%EB%8B%A8%EB%B0%B1%EC%A7%88%20X%EC%99%80)

② 表面等离子共振

③ 等温滴定量热法

④ 凝胶色谱法

⑤ 核磁共振波谱

⑥ X射线晶体学

⑦ 冷冻电子显微镜

⑧ 放射性配体结合测定

2.细胞实验

⑴ 显微镜

① 【光学显微镜】(https://jb243.github.io/pages/783)

② 扫描电子显微镜（SEM）：表面结构观察

③【透射电子显微镜】(https://jb243.github.io/pages/782)(TEM)：内部结构观察

④ 【扫描隧道显微镜】(https://jb243.github.io/pages/1329) (STM)：表面结构观察

⑤ 原子力显微镜（AFM）

⑥ 暗视野显微镜

⑦ 荧光显微镜

⑵ 细胞培养

① 类型 1. 基于 Transwell 的模型

○ 迁移

○ 入侵

○ 跨内皮迁移

② 类型 2. 基于球体的模型

○ 细胞悬浮培养

○ 非粘附表面

○ 悬滴法

○ 微流控器件

③ 类型 3. 混合模型

○ 嵌入式离体肿瘤切片

○ 3D入侵模型

○ 无血管微流控模型

④ 4. 肿瘤微血管模型

○ 预定义 ECM 支架

○ 微血管自组装

⑶ 细胞计数

① 血球计数板

○ 最初用于计数红细胞和白细胞

○ 使用血细胞计数器的细胞定量方案

② 犁刀计数器：电子粒子计数

○ 第一^第一。细胞被狭窄的孔隙吸入，导致电流发生变化

○ 第二^第二。电流变化产生脉冲

○ 第三^第。机器计数脉冲以计算细胞数量

○ 特点：不仅可以进行细胞计数，还可以进行细胞大小测定、活细胞比例定量、聚集细胞定量

③ 单层染色

○ 将细胞直接固定在多孔板或寺崎板上并染色计数

○ 细胞数很少时可以使用

④ 电池重量

○ 当细胞数量非常高时，偶尔使用会出现不准确的情况

○ 示例 1. 小鼠白血病（例如 L5178Y）

○ 直径：11-12 μm。体积：800μm³

○ 细胞数/g × 10⁶：1250（计算值）、1000（实测值）

○ 示例 2. 海拉

○ 直径：14-16 μm。体积：1200μm³

○ 细胞数/g × 10⁶：800（计算值）、250（实测值）

○ 实施例 3. 人二倍体成纤维细胞

○ 直径：16-18 μm。体积：2500 μm³

○ 细胞数/g × 10⁶：400（计算值）、180（实测值）

⑤ 流式细胞仪

○ 通过抗原抗体反应识别具有特定抗原的细胞，从而确定细胞悬液中细胞的类型和数量

○ 如果加上分选所需细胞的功能，则称为FACS（荧光激活细胞分选仪）

⑷ 细胞染色

①【细胞毒性实验】(https://jb243.github.io/pages/427)：XTT实验、WST实验、CCK-8实验等。> ②【油红O染色】(https://jb243.github.io/pages/447)：脂肪细胞分化评价

③【茜素红S染色】(https://jb243.github.io/pages/447)(茜素红S染色)：成骨细胞分化评价

④ DCF染色（二氯荧光素测定）：ROS评估

⑤ 尼氏体（尼氏物质）

○ 核糖体和粗面（颗粒状）内质网被染色，产生老虎（豹状）图案。

○ 尼氏染色使用的染料是碱性（阳离子）染料。

⑥ 吉姆萨显带：富含 AT 的异染色质呈深色，富含 GC 的常染色质呈浅色的技术；用于核型分析。

图2. 雄性吉姆萨环带照片

⑸ DNA技术

① DNA重组

② 基因库

③ PCR (聚合酶链反应）

④ 【DNA指纹识别】(https://jb243.github.io/pages/77#footnote_link_67_53)

⑤ 【杂交】(https://jb243.github.io/pages/77#footnote_link_67_54): Southern blotting、Northern blotting、Western blotting、DNA芯片（微阵列）、ISH（原位杂交）

⑥ 【基因删除】(https://jb243.github.io/pages/77#footnote_link_67_55)：基因敲除小鼠、Cre-lox、siRNA

⑦【核移植】(https://jb243.github.io/pages/77#footnote_link_67_56)：核移植、转基因生物、转基因食品

⑧ DNA-蛋白质相互作用研究：遗传(DNA)指纹、EMSA、ChIP

⑨ 蛋白质-蛋白质相互作用研究：二杂交系统、酵母二杂交

⑩ 【基因治疗】(https://jb243.github.io/pages/77#footnote_link_67_59)：CRISPR/Cas9基因编辑技术、siRNA治疗、mRNA药物输送系统

⑹ _体外_测序

① 测序方法

○ 体外克隆

○ 双脱氧链终止法

○ 染料-双脱氧链终止法

○ 焦磷酸测序

○ Illumina 固相放大

② 测序应用

○ WGS（全基因组测序）

○ WES（全外显子组测序）

○ ChIP-seq

○ scRNA-seq（单细胞RNA测序）

○ 亚硫酸氢盐测序

○ Hi-C 测序

○ 长读测序

○ 非侵入式测序

⑺【微生物实验】(https://jb243.github.io/pages/1487)

3.组织实验

⑴ 组织观察

① H&E染色

○ 概述

○ “H”代表苏木精，碱性染料； “E”代表曙红，一种酸性染料。

○ H&E 染色是临床病理学中确定患者疾病并指导治疗的标准方法。

○ 第 1 步： 固定

○ 通常使用 10% 中性缓冲福尔马林进行，以防止组织自溶和微生物腐败。

○ 第 2 步： 总剖面（总剖面）

○ 将组织修剪至适当的大小和形状。

○ 第 3 步： 清洗

○ 第 4 步： 组织处理

○ 4-1. 脱水：去除组织中的水分。

○ 4-2. 清除：用二甲苯代替脱水用的酒精。

○ 4-3. 渗透：用石蜡渗透组织。

○ 第 5 步： 嵌入

○ 形成石蜡块以实现薄切片；使用包埋中心。

○ 第 6 步： 切片

○ 切割至适合显微镜观察的厚度；使用切片机。» ○ 第 7 步： H&E 染色和封片

○ 用 H&E 对石蜡切片进行染色，并盖上盖玻片进行显微镜检查。

○ 细胞核：苏木精染成紫色。

○ 细胞质：伊红染成红色。

○ 近年来，自动染色机等自动化设备广泛用于H&E。

图 3. H&E 染色

○ 第8步： 组织病理学解释

② 其他组织染色技术

○ 免疫组织化学 (IHC) 染色

○ ALP 测定（碱性磷酸酶测定）

○ ALP 是一种主要存在于肝脏和骨骼中的酶。

○ 在pH 10.5左右的碱性环境中，羟基磷灰石会水解。

○ 通过 405 nm 处的吸光度测量。

○ MT染色（马森三色染色）

○ 红色：细胞质、角蛋白、肌纤维、红细胞

○ 黑色：原子核

○ 蓝色：胶原蛋白、粘蛋白、胶原纤维

○ PAS（高碘酸-希夫）染色

○ 用于显现紫色糖原的特殊染色剂。

○ 还可检测其他多糖和粘液物质（如粘蛋白、糖蛋白）。

○ 琼斯银染色：基底膜染色

○ 天狼星红染色：观察红色胶原蛋白成分的特殊染色

○ Alcian Blue 染色：粘蛋白染色

○ pH 值图

○ DHE（二氢乙锭）染色：超氧化物的检测

○ 天狼星红染色：ECM 染色

○ Luxol fast blue：用于细胞病理学并评估脑白质的完整性。

○ Herovici 染色：对胶原沉积物进行染色。

○ PHH3 染色（磷酸化组蛋白 H3）。

⑵ 3D成像采集

① 活体成像

○ 实验过程

图4. 活体成像实验流程

○ GSL-1-cy3用于血管壁的活体成像。

② 3D免疫染色

③【其他3D成像设备】(https://jb243.github.io/pages/1202)

○ US：通过使用探头发射的超声波与血液反射的超声波之间的频率（多普勒）偏移来评估健康状况。

○ PET：一种三维非侵入性成像方式，可检测正电子发射放射性核素遇到电子并湮灭时产生的成对 γ 射线。

○ MRI：利用核磁共振无创评估组织或样本的磁弛豫特性。

○ CT：基于 X 射线的断层扫描，其中传输 X 射线的结构更容易显得更暗；使用对象周围的多个投影来重建 3D 图像。

○ SPECT：使用 γ 发射放射性核素进行断层扫描成像，其采集几何结构类似于 X 射线 CT。

○ TPEM（双光子激发显微镜）。

⑶ 组织毒性试验

① 皮内反应

○ 评价皮内注射受试品后出现的局部刺激性。

○ 当动物刺激性测试不适用或测试物品具有疏水性时使用。

② 溶血试验

○ 评估红细胞溶解程度和血红蛋白释放。

○ 第一^第一。将血液添加到含有 EDTA 的真空收集管中并孵育。» ○ 第二^第二。孵育1小时后，离心。

○ 第三^第。收集上清液并测量血红蛋白释放的程度。

○ 第 4。溶血率（%）=（供试品溶液吸光度－空白吸光度）÷（阳性对照吸光度－空白吸光度）×100。

③ 血小板聚集试验

○ 类型 1： 血小板计数。

○ 2 型： 血小板聚集。

○ 类型3：血细胞粘附测量：粘附细胞越少，表明血液相容性越高。

④ 免疫学检测

○ 第一^第一。外周血单核细胞（PBMC）遇到异物，引发炎症反应，并产生各种细胞因子。

○ 第二^第二。通过逆转录 PCR 或酶联免疫吸附测定 (ELISA) 量化产量。

⑤ 血浆蛋白凝固试验

○ 评估血浆蛋白在材料表面的行为。

○ 血浆蛋白包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白等。

○ 血浆蛋白凝固试验的类型：

○ 部分凝血活酶时间 (PTT)

○ 凝血酶原时间 (PT)

○ 凝血酶时间 (TT)

○ 纤维蛋白原

○ 纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物（FDP）

○ 特异性凝血因子测定

○ FPA、D-二聚体、F₁₊₂、TAT

○ Lee–White 法

○ 今井鼻法

⑥ 【血液学检查】(https://jb243.github.io/pages/1473)

⑷【_原位_测序】(https://jb243.github.io/pages/75#footnote_link_67_52)

① ISS（_原位_测序）

② 空间转录组学

4.动物实验

⑴概述：对应临床前实验

⑵ 动物实验的一般流程

①【实验动物观察】(https://jb243.github.io/pages/1936)

②【校准、给药、采血】(https://jb243.github.io/pages/1937)

③【麻醉方法、安乐死、尸检】(https://jb243.github.io/pages/1938)

④【毒性测试】(https://jb243.github.io/pages/1939)

⑤ 【肿瘤模型】(https://jb243.github.io/pages/2137)

⑥ 动物实验规定：化妆品一般禁止进行动物实验。

⑶ 资源

① 杰克逊实验室 (ref1, ref2, ref3)：提供与动物实验相关的有用资源

⑷【药理学】(https://jb243.github.io/pages/2197)

①与药物及给药相关的机体生化反应研究

② 分为药效学（PD）和药代动力学（PK）

**5.临床试验

⑴概述：涉及人类。通常按顺序进行：细胞实验→动物实验→临床试验。

① 药物开发阶段

○ 药物发现：3~5年

○ 临床前：1~2年

○ 临床试验：6~7年

○ FDA批准：1~2年

②每年约有50~60种新药获得FDA批准。

③成本增加，故障率90%左右。

④ 大多数失败是由于缺乏治疗效果。

○ 即使在第一阶段，我们也通过关注功效和剂量发现来努力防止这种情况发生。

○ 引入 0 期研究是为了更快地向人类给药。

○ PET 成像也可以用作一种策略。

⑵ 一期临床试验：探索性临床试验

① 参与人数20~80人

② 类型1：如果目的是安全评估，则使用健康志愿者。

③ 类型2：抗癌药物：在少数晚期癌症患者身上进行测试。

④ 目标

○ 药代动力学：ADME理论

○ 互动

○ 安全性（剂量依赖性）» ○ 最大耐受剂量（MTD）、耐受剂量范围、剂量反应研究

○ PK/PD 研究

⑤ 方法

○ 剂量反应曲线：NOAEL、NOEL、MED（最小有效剂量）、MABEL

○ 单剂量上升、多剂量上升

○ 药物相互作用

⑶ 二期临床试验：更多参与者参与，探索性临床试验

① 参与人数100~200人

② 早期2期临床试验（IIa）：评估疗效

③ 后期2期临床试验（IIb）：剂量发现

⑷ 第三阶段临床试验：获得市场批准的临床试验的最后阶段。验证性临床试验

①大规模进行统计确认

② 目标：确认安全性和治疗效果

③ 上市一般需要5~6年左右（长期）

⑸ 四期临床试验：新药上市后疗效和安全性的长期评估

① 上市后监测

输入： 2019.11.30 10:43

最后更新： 2022.11.07 22:51

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第 37 章生物学实验

1.定量实验

2.细胞实验

3.组织实验

4.动物实验

**5.临床试验

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