第 9 章 DNA 技术
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1. DNA重组
2. DNA 文库
3. PCR
4. DNA 指纹
5. 杂交
6. 基因删除
7. 核替代
10。 基因编辑
a. 【核酸（DNA、RNA）提取纯化实验】(https://jb243.github.io/pages/1482)
b. 蛋白质印迹实验
c. 罗曼诺夫王朝与法医学
1. DNA重组
⑴ 第一名。从 mRNA 生成靶基因（对于真核 DNA）
① mRNA逆转录合成cDNA（DNA与mRNA的互补）。
② RT-PCR：将DNA引物加入到mRNA溶液中，并用逆转录酶（RT）处理一次。
○ Oligo dT 引物：以真核 mRNA 中存在的 Poly A 尾为模板，能够合成完整的 cDNA。
○ 随机引物（通常是六聚体）：可以形成多种cDNA pool。
③ RT-PCR：像普通PCR一样扩增cDNA量。
⑵ 第二第二。重组质粒
①限制性内切酶：核酸内切酶的一种。一把可以切割 DNA 的剪刀。
○ 细菌中产生限制性内切酶，用于靶向并降解外源 DNA。
○ 他们自己的 DNA（可以作为目标）受到甲基化的保护。
○ 平末端：被限制性酶切割后无法重新连接的末端。
○ 粘性末端：被限制性酶切割后可以重新形成互补氢键的末端。
○ 形成粘性末端的限制性酶用于 DNA 重组。
○ 回文识别：从5’到3’读取时，有义链和反义链上的序列是相同的。
○ 上面的例子是粘性末端。
○ 限制性内切酶的例子
○ AgeI: 5’-A▼CCGGT-3’
○ 铝: 5’-AG▼CT-3’
○ BamHI: 5’-G▼GATCC-3’
○ BglII: 5’-A▼GATCT-3’
○ DpnI: 5’-G metaA ▼TC-3’
○ DpnII: 5’-▼GATC-3’
○ EcoRI: 5’-G▼AATTC-3’
○ FspEI: 5’-CmC(N)12▼-3’
○ HindIII: 5’-A▼AGCTT-3’
○ HpaII：在 5’-C▼CGG-3’ 处切割，但不在 5’-CmC▼GG-3’ 处切割，其中 mC 代表甲基化胞嘧啶。
○ LpnPI: 5’-CmCDG(N)10▼-3’
○ McrBC: 5’-PumC(N40-3000)PumC-3’
○ MspI：5’-C▼CGG-3’、5’-C▼mCGG-3’，其中 mC 代表甲基化胞嘧啶。
○ MspJI: 5’-mCNNR(n)9▼-3’
○ MSTII：5’-CCTN▼AGG-3’，其中是具有 n 回文结构的核苷酸序列。
○ NcoI: 5’-C▼CATGG-3’
○ PstI：5’-CTGCA▼G-3’
○ SalI: 5’-G▼TCGAC-3’
○ Sau3AI: 5’-▼GATC-3’
○ SmaI：5’-GGG▼CCC-3’，形成平端。
○ XbaI: 5’-T▼CTAGA-3’
○ BamHI 的重组序列也会被 Sau3AI 切割。相反的情况仅在特定情况下成立。
○ BglII 的片段和 BamHⅠ 的片段相互结合，不会被限制性酶再次切割。
○ 当线性 DNA 被限制性酶切割一次时，它会变成两个片段，而环状 DNA 当被限制性酶切割一次时，会变成单个片段。
○ 限制性映射> ② 第 2第-1第。用相同的限制性内切酶切割目的DNA和质粒DNA，形成相同的粘性末端。
○ 第2第-1第-1第。为了防止仅用一种限制性酶处理时发生自连接，请用碱性磷酸酶（例如小牛肠磷酸酶 (CIP)）处理。
○ 第2第-1第-2第。通过用两种或多种类型的限制性内切酶处理，为质粒 DNA 与靶标 DNA 的结合提供方向性。
③ 第二第二-2第二。将截短的基因和质粒插入一根试管→互补的粘性末端相互结合。
④ 第2第-3第。通过用 DNA 连接酶连接来创建重组质粒。
⑶ 第三第三。转化：将重组基因插入宿主细胞（细菌）中诱导转化。
① 转型过程
○ 第 3 -1第。 CaCl2：Ca2+ 与磷脂结合并稳定细胞膜。
○ 第 3-2第。热冲击42℃：细胞膜上形成临时孔，使重组质粒能够插入宿主体内。
② 宿主：大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞等。
○ 要获得重组基因的产物，必须将其放入具有代谢功能的宿主细胞中。
○ 条件1. 第一代周期要短。
○ 条件 2. 易于在廉价培养基上培养和生长良好。
○ 条件 3. 不致病。
○ 条件 4. 筛选过程中抗生素不耐受。
③载体：携带并复制重组DNA的质粒或噬菌体DNA。
④ 克隆载体：用于基因复制的载体。
○ 四个条件：复制起点（ori）、启动子、限制性内切酶识别序列、选择标记（抗生素抗性基因）
○ 附加条件：体积小、拷贝数高
○ 克隆位点
⑤ 表达载体：在其他不同表达系统的宿主中表达外源基因的载体。
○ 原核宿主条件：启动子、SD序列、70S核糖体结合位点、转录终止子。请注意，克隆基因是cDNA。
○ 还需要处理三级结构（例如二硫键）的蛋白质。
○ 真核宿主条件：启动子、多聚A序列
○ 示例：当启动子连接在 lac 操纵子的激活基因之后时。
⑥ 矢量示例
○ 实施例1. pBR322质粒
○ 4361 bp。奥里在场。
○ 具有EcoRI、BamHI、HindIII等限制性内切酶的识别序列。
○ ampr：来自质粒pBR322的氨苄青霉素抗性基因，被PstI识别。
○ tetr：来自质粒pBR322的四环素抗性基因，被HindIII、BamHI和SalI识别。
○ 重组菌株：选择四环素敏感、氨苄青霉素耐药的菌株。
○ 实施例2. pUC19质粒
○ 2686 bp。奥里在场。
○ 具有 ApaLI 等限制性内切酶识别序列。
○ lacZ：使用X-gal作为底物产生蓝色产物。
○ ampr
○ 实施例3. Ti质粒
○ 根癌农杆菌（放射根瘤菌）：植物冠瘿（良性肿瘤）的病原体。
图 1. 放射根瘤菌附着在胡萝卜细胞上
○ Ti质粒：放射根瘤菌质粒，包括T-DNA。
○ T-DNA：20 kb DNA 编码冠瘿和生长素·细胞分裂素合酶（形成冠瘿）。
○ 观点：放射根瘤菌的营养来源。»> ○ 过程：根癌农杆菌感染植物→vir（毒力DNA，25bp）切割T-DNA两端，随机插入植物核染色体中。
○ DNA重组：损伤植物并用重组放射根瘤菌感染后，将目标DNA插入T-DNA区域。
○ 重组根癌农杆菌不合成生长素或细胞分裂素，可防止冠瘿瘤的形成。
○ 示例 4. pBHA
○ 示例 5. pBIC-A
○ 实施例6. 基因文库载体：BAC Library、YAC Library
○ 实施例7. 细菌质粒：F质粒、R质粒（插入抗生素抗性基因）。大约 1-10 kb。
○ 实施例8. 病毒载体
○ 遗传信息通过细菌感染、增殖、裂解、释放和裂解插入细菌DNA中。
○ 主要使用λ噬菌体（约25 kb）。
○ 有时使用逆转录病毒。
○ 实施例9. Cosmid：采用体外包装方法引入噬菌体cos端，大小约50 kb。
○ 实施例10. pOXA-48质粒
○ 合成碳青霉烯酶以产生对碳青霉烯（一种 β-内酰胺抗生素）的抗性
○ 像这样，β-内酰胺酶基因创建β-内酰胺环，从而赋予青霉素抗性。
⑷第4次。筛选：筛选具有重组基因的细胞或群体
①抗生素抗性基因（根据重组质粒正确插入进行选择）
○ 示例：氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因
○ 第一第一。复制品形成：孵育整个菌落后，将整个培养板压印到滤纸上。
○ 第二第二。将抗生素添加到印在滤纸上的菌落的一部分中。
○ 第三第。因抗生素而死亡的菌落表明它们没有被转化。
○ 第 4。选择与滤纸上抗生素存活下来的菌落相对应的菌落。
②抗生素抗性基因（根据重组成功选择）
○ 第一第一。复制品形成：孵育整个菌落后，将整个培养板压印到滤纸上。
○ 第二第二。将抗生素添加到印在滤纸上的菌落的一部分中。
○ 第三第。因抗生素而死亡的菌落表明限制性内切酶切割了抗生素抗性基因。
○ 第 4。选择与滤纸上因抗生素而死亡的菌落相对应的菌落。
③ X-gal（根据重组成功选择）
○ 将克隆基因插入lac Z基因中。
○ 第一第一。 X-gal原本是白色的，但由于lac Z而变成蓝色。
○ 第二第二。如果用带有 lacZ 的质粒处理的菌落在 X-gal 上显示为白色，则表明转化成功。
④ 报告基因
○ 使用宿主细胞中不表达的基因。
○ 示例：eGFP、tdTomato。
⑤ Southern 印迹
⑸第五th。克隆扩增：通过大量发酵和纯化获得大量产物。
① 大规模培养耐药质粒时使用抗生素的原因（非选择性目的）
○ 第一第一。细菌菌株内的质粒在细胞分裂过程中随机分布到子细胞中。
○ 第二第二。随着分裂的继续，一些细胞最终没有任何质粒。
○ 第三第。含有质粒的细胞复制它们需要消耗更多的能量，导致与不含质粒的细胞相比生长速度存在差异。
○ 第 4。最终，无质粒细胞成为大多数。”
② 包涵体» ○ 由于转化过程中引入的基因最初并不存在于宿主中，因此产生的蛋白质可能无法正确折叠并聚集。
⑹ 示例
①激素及生物活性物质：生长激素、胰岛素、促胰液素等。
② 治疗诊断试剂：乙型肝炎疫苗、HIV感染诊断、干扰素、新内啡肽、镇痛药、凝血因子等。
③农业：黄金稻、抗除草剂作物、抗虫作物
④ Ti质粒转基因新功能作物：耐除草剂、抗炭疽作物（种薯等）
⑤ 重组菌株开发策略
○ 反馈/抗生素耐药突变体
○ 营养缺陷型突变体
○ 过度表达突变体
2.DNA文库
⑴ DNA文库载体
① 细菌人工染色体（BAC）
○ 优点：不发生交叉。
○ 缺点：必须适应原核表达系统。
○ 用于人类基因组计划。
○ 至今仍在使用。
② 酵母人工染色体（YAC；pYAC3）
○ 酵母中的人工染色体 (~1 Mb)，包含 ARS，并将 DNA 插入着丝粒和端粒之间。
○ 优点：利用真核系统，适合生产人类蛋白质。
○ 缺点：交叉发生在减数分裂前期 I。
③病毒基因组文库
○ 缺点：容量小。难以控制繁殖。
⑵ 所需DNA元件
① 着丝粒：富含 GC 的序列，在细胞分裂过程中附着在纺锤体纤维上，确保染色体正确分布到每个子细胞。
② 端粒：位于染色体末端的核苷酸序列，可防止细胞分裂导致染色体缩短。
③复制起点：DNA复制开始的部位。
④ 选择标记：用于确认人工染色体正确插入细胞的特定 DNA 序列。
⑤其他：启动子、基因表达调控机制。
⑶ 类型
① gDNA 文库
○ 第一第一。用苯酚处理沉淀组蛋白。
○ 第二第二。核酸存在于基因组DNA上清液中。
○ 第三第。分离上清液→三氯乙酸→核酸沉淀。
○ 第 4。用限制性酶消化 gDNA 后，克隆所有片段并将其插入 BAC 载体中。
○ 第五th。选择性扩增含有目标 DNA 的大肠杆菌。
○ 第六th。用于内含子研究。
○ Triton X-100 是两亲性的，不会使 DNA 结构变性。
○ SDS-PAGE 会使 DNA 结构变性。
② cDNA文库
○ 第一第一。 亲和层析：将oligo-dT (poly T)附着到珠子上。
○ 第二第二。使用逆转录酶对分离的 mRNA 进行逆转录。
○ 第三第。用低浓度的 RNase 处理：充当引物。
○ 第 4。用 DNA 聚合酶 I 处理。
○ 第五th。用连接酶处理。
○ 第六th。用限制性酶处理。
○ 7th。插入向量中。
○ 第八th。克隆扩增。
○ 9th。用于基因表达的研究。
③ 文库筛选
○ 将文库克隆转移到过滤器上并用探针激活，以识别包含与探针相同序列的克隆的位置。
3. PCR
⑴ 概述
①定义：基于DNA复制原理的DNA扩增技术。
②1983年由Kerry Mullis开发；他于1993年荣获诺贝尔化学奖。⑵ 样品：DNA样品、DNA引物（2种）、dNTP、Taq聚合酶、Buffer（pH稳定）、MgCl2（DNA稳定）
① DNA引物
○ 条件1： GC含量＞50%
○ 示例：18 个碱基中的 10 个（= 18/2 + 1）是 G 或 C
○ 示例：20 个碱基中有 11 个 (= 20/2 + 1) 是 G 或 C
○ 条件2： 5’端应以AT结尾，3’端应以GC结尾
○ 原因：防止自结扎形成发夹
○ 示例：5’-ATGCCTATGCG-3’
○ 示例：5’-ATGCAGGCTAAT-3’ 可导致自连接
○ 条件3： 3’端应有2至3个重叠的G或C
○ 原因：A=T键是双键，而G≡C键是三键，使得富含GC的序列更稳定
○ 示例：5’-ATGCCTATGCG-3’
② dNTP
○ 请注意，NTP 是 RNA 聚合的构建模块。
○ 为何出现 E 的原因。在菌落 PCR 中，可以使用大肠杆菌 菌落代替 DNA 模板：由于热诱导变性。
○ 换句话说，E。大肠杆菌 菌落在变性下被分解，为 DNA 聚合提供必要的材料。
③ Taq聚合酶
○ Taq聚合酶源自栖息在高温温泉中的古细菌Thermus Aquaticus。
○ 20 世纪 60 年代在黄石国家公园首次发现。
○ Taq 聚合酶的最佳聚合温度为 55°C，在 92–95°C 时变性。
○ 完成 3’ 末端聚合后，Taq 聚合酶会添加额外的 A 核苷酸。
○ 由于不需要模板，因此可以应用于具有平端序列的重组 DNA。
○ Taq 聚合酶缺乏 3’ → 5’ 校对能力，导致错误率为 1/104。
○ 相比之下，典型的 DNA 聚合酶的复制错误率为 1/107。
④ 氯化镁2
○ DNA 具有带负电的磷酸盐骨架，导致结构不稳定 → Na+ 或 Mg2+ 可以稳定 DNA。
⑤ IPP（无机焦磷酸酶）
○ 增强 NTP 的结合。
⑶ 工艺流程
① 第一第一。加热步骤可分离两条 DNA 链。 94℃。 30-60秒。
② 第二第二。退火：当混合物冷却时，引物与 DNA 模板结合。 50-55℃。 1 分钟。
③ 第三第。 DNA 延伸：聚合酶在引物处开始合成。 72℃。每 1000 bp 1 分钟。
④ 第 4。理论上，重复步骤 ① 至 ③ 会导致 DNA 样本指数扩增 2 倍。
⑤ 第 5。 DNA连接酶作用（40℃）和稳定化（4℃）。
⑥ 第六th。几个循环后切换到大肠杆菌克隆扩增：实际上，人工核苷酸的量不足，产生的 DNA 少得多。
⑷ Tm 与退火温度
① DNA 熔解曲线：DNA 变性程度随温度变化的图形表示。
○ 利用 260 nm 处的吸光度（A260）显示线性双链 DNA 在不同温度下的变性程度。
○ A260值比较：双链DNA＜单链DNA＜片段化核酸
○ 原因：较少的碱基堆叠导致较低的屏蔽和较高的吸光度。
② Tm（熔解温度）：50% 的 DNA 保持双链，而另外 50% 变性为单链时的温度。
○ 一般与(A + T) × 2 + (G + C) × 4 成正比。
○ Tm 值与重复序列无关。
○ 由于RNA稳定dsRNA中的-OH基团，dsRNA的Tm比相同序列的dsDNA高约15℃。
③ 退火» ○ 退火温度通常设置为低于 Tm 5–10°C。
○ 退火温度太高，杂交效率低下；如果太低，错误杂交就会增加。
○ 金属离子的存在影响最佳退火温度。
⑸ Ct（阈值周期）
①定义：信号超过阈值的周期。
② Ct与拷贝数呈负相关。
⑹ 限制：模板DNA两端的核苷酸序列必须已知。
① 假设：如果中间有已知序列且模板DNA具有平端，则可以克服此限制。
② 溶液1. 反向PCR
○ 第一第一。使用 DNA 连接酶从模板 DNA 形成环状 DNA。
○ 第二第二。使用限制性内切酶在已知序列内进行切割，生成线性 DNA。
○ 第三第。 PCR 是可能的，因为我们知道两端的序列。
③ 解决方案 2. 锚定 PCR
○ 第一第一。使用 DNA 连接酶将新引物连接至模板 DNA 并扩增一半。
○ 第二第二。另一半也经历同样的过程。
④ 解决方案3. 寡核苷酸定向诱变
○ 情况 1： 使用仅有少数不匹配碱基的引物复制模板 DNA。
○ 案例 2： 使用引物复制模板 DNA，其中添加了核苷酸序列，可在中间诱导发夹结构。
○ 情况3： 使用去除了核苷酸序列的引物复制模板DNA，使模板DNA形成发夹结构。
⑺ 类型
① RT-PCR：包括利用逆转录酶从RNA合成cDNA的过程。
② 实时PCR（qPCR，定量PCR）：可以实时监测扩增的DNA数量。
○ 最初，给定的核苷酸片段不发出荧光，因为荧光报告基团和猝灭基团之间的距离太短。
○ 在 PCR 聚合过程中，荧光报告基团和猝灭基团分离，从而出现荧光。
○ TaqMan qPCR：TaqMan 探针（含有荧光团和猝灭剂）与目标 DNA 结合，并在 DNA 合成过程中被切割，产生荧光。
③ 多重PCR：在一次PCR反应中扩增多种类型的DNA样本。
④ 等位基因特异性PCR (AS-PCR)：一种利用PCR 检测等位基因特异性变异的方法。
4. DNA 指纹分析
⑴ 概述
①目的：亲子鉴定、遗传病预测、法医凶手鉴定。
② 利用这样一个事实：除了同卵双胞胎之外，没有两个人的基因是相同的。
⑵ 电泳：可以根据尺寸分离物质并估计其数量。
①固定相、流动相
○ 固定相（压缩凝胶、浓缩凝胶）
○ 凝胶密度越高，DNA 样品或蛋白质的运输速度就越慢。
○ 高凝胶密度的原因：无论 DNA 样本或蛋白质大小如何，都保持移动速度恒定。
○ 流动相（电泳胶）
○ 低凝胶密度允许 DNA 样品或蛋白质快速移动。
○ 凝胶密度为6-15%。
② 核酸电泳：琼脂糖凝胶
③蛋白电泳：聚丙烯酰胺凝胶+双丙烯酰胺凝胶、SDS-PAGE、TEMED
○ 材料 1. 丙烯酰胺：在凝胶中形成聚合物。
○ 材料 2. RIPA 缓冲液：等渗溶液。用作细胞裂解的缓冲液。
○ 材料 3. 上样缓冲液或 Laemmli 样品缓冲液：破坏二硫键的缓冲液。
○ 不含甲醇，但包含 SDS-PAGE。
○ SDS-PAGE：用于更有效的分离。应用于变性凝胶。»> ○ SDS-PAGE 由 SDS（阴离子表面活性剂）和 β-ME（β-巯基乙醇）组成。
○ SDS：去除离子键和疏水相互作用。均衡蛋白质每单位质量的电荷密度。
○ β-ME：消除二硫键。
○ 当 SDS-PAGE 与每个氨基酸结合时，负电荷之间的排斥导致所有蛋白质具有相同的电荷密度，形成二级结构。
○ DTT：一种破坏半胱氨酸残基之间二硫键的添加剂。
○ 材料 4. 转移缓冲液：用于从凝胶转移到膜。
○ 含有甲醇，但不包括 SDS-PAGE。
○ Native-PAGE：用于非变性凝胶。
○ 甲醇：具有冷却转印过程中产生的热量的作用。
○ 材料 5. 过硫酸铵 (APS)：作为一种酶，在聚丙烯酰胺和双丙烯酰胺凝胶之间形成交联。
○ 材料6. TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）：稳定APS并帮助凝胶快速固化。
④ 通常顶部为阳极，底部为阴极。
⑤ 移动距离 = Δt × (a × log M + b), a < 0, M: 分子量
○ 当用SDS等特殊物质处理时，分子量与尺寸成线性正比，导致流动相阻力更大，迁移距离更短。
○ 分子量对迁移距离影响最大。
○ 迁移距离与时间（Δt）成正比。
○ DNAladder（尺寸标记）：提供基于尺寸的迁移距离，可以估计未知物质的尺寸。
○ 超螺旋 DNA 的电泳阻力较小。
⑥ 类型1. 普通电泳
○ 分子量较小的核酸和蛋白质迁移得更远。
○ **在蛋白质电泳中，SDS-PAGE 导致蛋白质从 (-) 电极迁移到 (+) 电极。
⑦ 类型2. 等电电泳：使用等电点进行电泳，等电点是蛋白质的独特值。
○ pH 梯度电泳可将蛋白质移动至总电荷为零的点（等电点）。
○ 电泳后，使用考马斯蓝或硝酸银等蛋白质染料对蛋白质进行染色。
图 2. 等电电泳
⑧ 类型 3. 2D 电泳
○ 奥法雷尔定律很常见。
○ X 轴：通过尿素存在下的等电电泳或非变性条件下的电泳基于电荷进行分离。
○ 换句话说，根据等电点发生分离。
○ 尿素：消除除二硫键外的所有 R-R 相互作用。
○ Y 轴：在 SDS 存在下通过电泳根据分子量进行分离。
○ 可分离1000多种蛋白质。
○ 应用 1. 使用相同的方法分离 X 轴和 Y 轴，但在 Y 轴分离时添加特定物质 → 偏离对角线的物质表示与添加的物质发生相互作用。
○ 应用2. 对于tRNA和小RNA分子：1D使用10%聚丙烯酰胺凝胶，2D使用20%聚丙烯酰胺凝胶 → 有效分离各种类型的RNA。
⑶ 指纹识别方法1. RFLP（限制性片段长度多态性）：亲子鉴定、遗传病分析
①过程：目标基因。
○ 第一第一。从组织中分离 DNA。
○ 第二第二。 PCR：扩增 DNA 量。
○ 第三第。使用限制性内切酶将 DNA 切割成片段。
○ 第 4。生成具有相同限制性内切酶识别位点的不同大小的 DNA 片段。» ○ 第五th。电泳：根据大小差异分离片段以进行可视化。
②原因：单核苷酸多态性（SNP）
○ 定义：人与人之间因某一碱基因点突变而不同而产生的差异。
○ 在人类中，每 1,000 个碱基对 (bp) 中大约出现一个 SNP。
○ SNP 可以出现在外显子和内含子中。
○ 如果限制性内切酶识别位点出现 SNP，则可能会出现 RFLP。
○ 突变与多态性的区别：如果发生率低于整个群体的1%，则认为是突变；否则，它被归类为多态性。
○ SNP 数量：截至 2017 年，SNP 数量约为 10,000 个。
图 3. SNP 数量
③局限性：由于SNP不一定出现在限制性内切酶识别位点，因此个体之间RFLP变异并不显着。
○ 难以用于犯罪识别和类似应用。
⑷ 指纹法2. 串联重复序列：用于嫌疑人识别。比 RFLP 更强大的基因指纹识别方法，针对重复序列。
① VNTR（可变数量串联重复序列）：15-100次重复
○ 原理：个体之间重复序列的重复次数不同，导致片段大小不同。
○ 原因：同源染色体交叉不均匀
○ 第一第一。使用电泳根据长度分离和扩增 DNA 片段。
○ 第二第二。将分离的 DNA 片段转移到滤纸上。
○ 第三第。转移到滤纸上后，进行化学处理（碱性）以破坏氢键→产生单链DNA。
○ 第 4。将 VNTR 片段的位置与标有放射性物质的 VNTR 探针进行比较。
○ 第五th。将滤纸暴露于 X 光胶片时会出现条带。
② STR（Short Tandem Repeat）：重复2-4次。
○ 与VNTR 没有显着差异。
⑸ 指纹识别方法3. 其他指纹识别方法
① CNV（拷贝数变异）
② LOH（杂合性丢失）
③ 基因组重排
④ 稀有变体
5.杂交
⑴ Southern blotting：核酸探针与DNA杂交。
① 概述
○ RFLP 的一种。
○ 由 Edward M. Southern 于 1975 年开发。
② 第一第一。酶切处理→PCR扩增→电泳
○ 电泳：使用琼脂糖凝胶。
○ 可以使用主板代替电泳：将含有重组质粒的菌落排列在固体培养基上。
③ 第二第二。将凝胶在 0.5 M HCl 溶液中摇动。
○ HCl 处理加速 DNA 从琼脂糖凝胶到膜的转移。
④ 第三第。将凝胶在 1.5 M NaCl、0.5 M NaOH 溶液 中摇动（DNA 变性）。
○ 将 NaOH 溶液、海绵和凝胶堆叠在一起，以便将 DNA 分离成单链。
○ 海绵吸收 NaOH 溶液并将其供给凝胶。
○ 为了防止双链 DNA 部分重组，添加了额外的核酸变性剂。
○ 核酸变性剂：金属离子、甲酰胺、甲醛等。形式系列削弱DNA结合强度。
⑤ 第 4。将凝胶在 1.5 M NaCl、1 mM EDTA、0.5 M Tris-HCl (pH 7.2) 溶液中摇动。
○ Tris-HCl：缓冲溶液。
⑥ 第 5。毛细管现象+印迹
○ 第 5 -1 。将带正电的尼龙过滤器和纸巾放在凝胶上。
○ 可用硝化棉纸代替尼龙滤纸。» ○ 第 5第-2第。进入凝胶的 NaOH 溶液携带单链 DNA，并流向纸巾堆并被吸收。
○ 第 5位-3位。带负电荷的单链 DNA 粘附在尼龙膜上。
⑦ 第六th。高压灭菌器：将与DNA结合的尼龙膜在高压和高温下处理以固定键合。
○ 当暴露于紫外线 (UV) 光时，DNA 也可以与膜结合。
○ 一般情况下，121℃灭菌15分钟即可杀死大部分微生物。
⑧ 第 7。封闭：添加封闭剂以提高透明度。
○ 7th-1st。通过对每个等位基因进行重复实验或电泳来识别被认为不重要的 DNA。
○ 7th-2nd。将鲑鱼精子 DNA 片段添加到 DNA 中。
○ 目的：防止探针DNA在第8次杂交过程中与膜非特异性结合（提高清晰度）。
○ 注意：膜与 DNA 或蛋白质强烈相互作用，需要封闭过程。
⑨ 第 8。杂交
○ 8th-1st。将结合有 DNA 的尼龙膜放入 Seal-a-Meal 袋中。
○ 8第-2第。在 62 °C 下，将放射性标记的 DNA 探针添加到 Seal-a-Meal 袋中。
○ 标记探针具有与目的基因互补的序列。
○ 探针 DNA：100–500 bp，单链 DNA。
○ 探针 DNA 通常用放射性同位素 P32 标记。
○ 探针 DNA 也可以用 EtBr 或 SYBR Green 等染料进行标记。
○ 第 8位-3位。探针与互补 DNA 结合。
○ 通过反复实验，其他被认为无关紧要的DNA被鲑鱼精子DNA封锁并覆盖。
⑩ 第 9th。消除密封餐袋中未杂交的放射性探针。
⑪ 第 10。放射自显影图：尼龙膜上的辐射。
⑫ 第 11th。识别电泳凝胶上的放射性位置（或集落位置）。
⑬ 看家基因
○ 存在于所有细胞中并持续表达的基因。
○ 用作 Southern blotting 中的对照。
○ 示例：β-肌动蛋白 (ACTB)、微管蛋白、GAPDH、B2M、RPL11、18S rRNA（最可靠）。
⑭ 严格性
○ 降低严格性的条件：创造一个更容易结合探针的环境。
○ 低温或高盐浓度有利于核酸杂交，导致严格性降低。
⑵ Northern blotting：核酸探针与RNA杂交。
① 与 Southern blotting 非常相似，但有以下差异。
② 差异1. 样本的提取
○ Southern blotting 使用 DNA 提取。
○ Northern blotting 使用oligo dT，通过亲和层析 从提取物中有效分离 mRNA。
③ 差异2. 限制性内切酶的使用
○ Southern blotting处理的DNA很长，必须与限制性酶一起使用。
○ Northern blotting 使用 RNA，而不是 DNA，因此不能使用限制性酶。
④ 差异 3. 毛细作用溶液的类型
○ Southern blotting 使用碱性溶液使单链 DNA 变性。
○ 在 Northern 印迹中，RNA 在暴露于碱性溶液时会被降解。
○ Northern blotting 使用盐溶液来稳定 RNA。
④ 差异 4. 探头类型
○ Southern blotting 使用 gDNA 探针。
○ Northern 印迹使用 cDNA 探针。
⑶ Western blotting：抗体探针与蛋白质的杂交。
① 与核酸印迹法存在诸多差异。
② 差异1. 凝胶类型
○ 核酸印迹使用琼脂糖凝胶。» ○ Western blotting使用聚丙烯酰胺凝胶、SDS-PAGE等。
③ 差异2. 电泳电压条件
○ 在核酸印迹中，核酸可以很好地转移至电泳，因此必须施加低电压。
○ 在蛋白质印迹中，蛋白质不能通过电泳很好地运输，因此必须施加高电压。
④ 差异 3. 印迹过程
○ 核酸印迹在印迹过程中利用毛细管现象。
○ 蛋白质印迹法在印迹过程中使用电场。
⑤ 差异4. 核酸预处理
○ 核酸印迹使用鲑鱼精子 DNA 片段。
○ 蛋白质印迹法使用酪蛋白、脱脂牛奶、牛血清白蛋白（BSA）等。
○ Tween：使用Tween-20等表面活性剂。
○ 美国Uniqema公司开发的品牌名称。
○ 由亲水基团（聚乙二醇）和疏水性烃基组成的洗涤剂。
○ 用途：帮助混合水和油，破坏细胞膜。
○ 数字20、40、60、80表示碳链长度增加，随着值的增加，洗涤剂的疏水性更强。
○ BSA 也可用于核酸印迹。
⑥ 差异 5. 探头类型
○ 核酸印迹使用 DNA 探针。
○ 蛋白质印迹法使用抗体探针。
○ 一抗：与目标蛋白特异性结合的抗体。
○ 为了确保一抗的特异性，必须使用从与目标动物不同的物种中提取的酶。
○ 二抗：与一抗特异性结合的抗体。它通常与分解显色底物的酶结合。
○ 为了确保二抗的特异性，必须使用从与目标动物和一抗宿主不同的物种中提取的酶。
○ 在蛋白质印迹中，一抗和二抗来自不同的物种。
⑦ 差异6. 成像方法
○ 核酸印迹采用 EtBr + 自辐射。
○ 蛋白质印迹法采用考马斯蓝染色法。
⑷ DNA芯片（微阵列）
① 特点
○ 同时检测多个基因的表达模式。
○ 每个点包含一个 cDNA 探针。
○ 允许使用 cDNA DNA 芯片识别组织特异性基因表达。
○ 微阵列数据由连续的原始数据组成，而 RNA-seq 原始数据是基于计数的。
○ 与微阵列数据相比，RNA-seq 在检测表达水平极低或极高的基因方面更加稳健。
○ 由于NGS（下一代测序）的进步而成为过时的技术。
② 流程
○ 第一第一。将人类基因的 cDNA 文库点样到载玻片上以创建 cDNA 芯片。
○ 第二第二。 cDNA 芯片用 1% BSA 溶液处理。
○ BSA 可防止芯片与 DNA 之间的非特异性结合，只允许互补的 DNA 结合。
○ 第三第。分别提取 mRNA X（来自正常组织）和 mRNA Y（来自异常组织，例如癌症）。
○ 第四th</sup。 Oligo-dT 添加到 X 和 Y，与 mRNA 中的 Poly-A 序列互补结合。
○ 第五th。 RT-PCR（逆转录 PCR）
○ X：dNTP + Cy3（绿色荧光染料）-dTTP。
○ Y：dNTP + Cy5（红色荧光染料）-dTTP。
○ 进行逆转录反应，生成荧光标记的 cDNA。
○ 第六th。将 0.1 N NaOH 添加到 X 和 Y，在 70°C 下孵育 10 分钟，然后用 0.1 N HCl 中和。
○ 模板RNA因碱性条件而被降解。» ○ 7th。将 X 和 Y 合成的 cDNA 纯化并等量混合，然后杂交到 cDNA 芯片上。
○ 第八th。用 缓冲溶液 清洗 cDNA 芯片以去除未结合的序列。
○ 9th。测量并校正 Cy3 和 Cy5 的荧光强度。
○ 黑色： X 和 Y 均不表达。
○ 绿色：仅表示 X。
○ 红色：仅表示 Y。
○ 黄色：X、Y 均被表示。
⑸ ISH（原位杂交）
① 概述
○ 将特定 DNA 序列与染色体杂交的实验技术。
○ 不仅可用于确定特定核苷酸序列的位置，还可用于识别RNA的位置。
○ 快速诊断染色体异常，但无法诊断DNA突变。
② 1 型. 荧光原位杂交 (FISH)
○ 将特定的核苷酸序列与与该核苷酸序列互补的荧光探针杂交，然后使用荧光显微镜观察。
○ 第一第一。在载玻片上准备上皮组织切片。
○ 第二第二。用 RNase 处理，37°C 孵育 1 小时，然后洗涤。
○ 与 DNA 结合的探针可能与 RNA 结合，因此有一个去除 RNA 的过程。
○ 第三第。除去培养基，加入2%甲醛溶液，孵育15分钟。
○ 此步骤修复细胞。
○ 第 4。除去甲醛溶液，添加0.2% Triton X-100溶液，并孵育5分钟。
○ Triton X-100 是一种表面活性剂。
○ 第五th。取出 Triton X-100 溶液，添加 2 M HCl，然后用胃蛋白酶处理并在 37°C 下孵育 10 分钟。
○ 胃蛋白酶在酸性条件下发挥作用，因此 pH 值会相应调整。
○ 胃蛋白酶降解细胞内蛋白质，促进后续步骤中的探针穿透。
○ 第六th。清洗样品。
○ 7th。准备与着丝粒结合的探针。
○ 该探针含有生物素标记的 dTTP。
○ 第八th。将步骤 4 中的样品与步骤 5 中的探针杂交。
○ 9th。清洗样品。
○ 第十th。用荧光标记的亲和素充分处理后，清洗样品。
○ 11th。用 DAPI 染色。
○ DAPI（4’-6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种核染色剂。
○ DAPI 与 DNA 小沟富含 AT 的区域强烈结合。
○ 也可用作细胞凋亡标记物。
○ 由于 DAPI 具有细胞膜渗透性，因此可用于对活细胞和固定细胞进行染色。
○ 当紫外线照射到与 DAPI 结合的 DNA 时，会发出蓝色荧光。
○ 12th。着丝粒区域将显示亲和素荧光，而 DNA 将显示蓝色荧光。
○ 应用1. RNA ISH（原位杂交）
○ rRNA 分子是在原位观察的，而不是从单个细胞中分离出来。
○ 标记的核糖核酸探针（互补 RNA 序列）与转录物杂交。
○ 通过与互补转录本结合的探针实现可视化。
○ 应用 2. WM ISH（整体安装 ISH）(1989)
○ 需要数千只动物才能创建地图集，因此 2010 年之后不再常用。
③ 2 型. 放射性 ISH：第一种 ISH 方法，于 1969 年开发。
⑹ 测序技术：确定DNA核苷酸序列。
⑺ 基因陷阱筛选
6.基因缺失
⑴ 基因敲除小鼠：研究特定基因的功能。
图4. 淘汰流程
> ① 第一第一。胚胎干 (ES) 细胞中 X 基因的敲除诱导
○ 1st-1st。质粒载体（靶向载体）的构建：包括通过插入neor（新霉素抗性基因）而失活的基因X，以及位于距离基因X一定距离的TK（胸苷激酶）基因。
图5. 质粒载体的结构
○ 第一第一-2第二。将靶向载体插入 ES 细胞内。
○ 第一第一-3第三。一些 ES 细胞自主地用失活的 X 基因替换现有的 X 基因。
○ 为了实现基因重组，基因 X 旁边必须包含相同的基因。
○ 第 1第-4第。选择：细胞在含有 G418（遗传霉素，新霉素衍生物）和更昔洛韦的培养基中培养。
○ 第 1第-4第-1第。未转化的 ES 细胞：被 G418 杀死。
○ 第 1第-4第-2第。 X 基因以外的区域被替换的 ES 细胞：这些细胞含有 TK 基因，使它们容易受到更昔洛韦诱导的细胞死亡的影响（TK 基因将更昔洛韦代谢成有毒化合物）。
○ 第 1第-4第-3第。只有 X 基因被替换的 ES 细胞才能存活。
② 第二第二。选择敲除 ES 细胞。
③ 第三第。将敲除 ES 细胞注射到胚胎中。
④ 第 4。 嵌合小鼠的生殖细胞由正常生殖细胞和源自敲除ES细胞的生殖细胞组成。
⑤ 第 5。 F1 小鼠包括 (+/+) 个体 和 (+/-) 个体。
○ 原因：因为嵌合体小鼠可以认为是杂合突变体。
⑥ 第六th。通过基因检测在F1小鼠中选择（+/-）个体并进行自交。
○ 根据小鼠毛色进行选择存在局限性。
⑦7th。 F2小鼠中，25%是基因敲除小鼠（纯合突变体），必须通过基因检测鉴定。
⑵ Cre-Lox
① Cre基因编码重组酶。
② Cre 介导的 DNA 重组仅发生在相同的 lox 序列之间。
③ 如果配对的lox序列方向相同，则Cre发生DNA缺失；如果它们的方向相反，则 Cre 会发生 DNA 倒转。
⑶ miRNA、siRNA：使用RNA干扰（RNAi）可以抑制所有基因的基因表达。
7.核替代
⑴ GMO（Genetically Modified Organism）：基因改变的物质、食物、生物体。
2 方法
① 核移植
○ 采用显微注射等技术。
○ 适用于性状转化和动物克隆。
② 不使用向量的特征转换
○ 可以利用基因枪等诱导性状转变。
○ 实施例1. 重组植物细胞的形成：涂有重组基因的颗粒被“射入”植物细胞中。
○ 实施例2. 重组植物细胞→愈伤组织→整株植物形成（在营养培养基中）。
○ 植物细胞表现出全能性。
○ 示例3. 纯种的维持和繁殖
○ 示例 4. 有用植物的增殖
○ 实施例 5. 具有分生组织区域的组织培养
○ 例6. 微分归纳
⑶ 实例
① 实施例1. 重组动物：在动物体内大规模生产有益基因产物。
② 示例2. 食用疫苗
③ 示例3. 转基因食品（GM Food）
○ 过去：通过选择性育种（人工选择）增加特定等位基因频率而获得的基因改造作物。» ○ 现在：基因重组技术 → 延长保质期、提高生产率（抗虫、杂草、疾病、干旱和寒冷）。
○ 示例3-1. 黄金大米：经过基因改造，生产β-胡萝卜素（增加大米的营养价值）。
⑷【转基因生物争论与安全评估原则】(https://jb243.github.io/pages/1432)
8. DNA-蛋白质相互作用研究
⑴ 基因足迹分析（DNA足迹技术）
图6. 基因足迹的应用
① 凝胶电泳中似乎缺少与蛋白质结合的基因。
② 可识别转录因子结合位点。
⑵ 电泳迁移率变动分析（EMSA；凝胶变动分析，GMSA）
① 确认转录因子与启动子之间的结合。
② 第一第一。探针生产：用放射性同位素标记 DNA。
③ 第二第二。对蛋白质-DNA 杂交体进行电泳，然后进行辐射敏感性分析。
④ 第三第。结果分析
图 7. EMSA 结果示例
○ 前提：由于顶部是阴极，底部是阳极，所以DNA会从上到下移动。 (-)表示仅移动探头的情况。
○ a的解释：Protein A和Protein B与探针结合，并且A和B与探针结合在一起（它们也可以彼此排他地结合…）。
○ b 的解释：Protein C 和 Protein D 与探针结合，C 和 D 不结合。
○ c的解释：蛋白E与探针结合，而蛋白F不与探针结合，但与蛋白E结合。
⑤ 一般来说，蛋白质是指转录因子，可用于测量转录活性。
⑶ ChIP（染色质免疫沉淀）
⑷ 西南印迹法
图 8. 西南印迹法
① 第一步：首先对蛋白质进行蛋白质印迹分析。
② 第二步：随后，将荧光标记的 DNA 进行 Southern blotting。
⑸ 酵母单杂交检测
⑹ 过滤器结合测定：只有转录因子与过滤器结合。
⑺ DNA亲和层析
9.蛋白质-蛋白质相互作用研究
⑴ 双杂交系统：一种鉴定与蛋白质X相互作用的蛋白质的方法。
① 第一第一。转录因子基因分为两部分：DNA结合域和转录激活域。
② 第二第二。诱饵：蛋白质 X + DNA 结合域。
③ 第三第。 Prey：用于确定结合+转录激活域的感兴趣蛋白质。
④ 第 4。当两种杂合蛋白相互作用并结合时，猎物会诱导报告基因的表达。
○ 报告基因示例：GFP 蛋白。
⑵ 酵母双杂交：利用蛋白质-蛋白质相互作用来鉴定蛋白质结合关系。
⑶ 使用GST标记的融合蛋白进行蛋白质分离和纯化。
⑷ 噬菌体展示法：用于获得单克隆抗体。
①目的：获得与特定蛋白结合的单克隆抗体。
② 体外获得单克隆抗体的方法。
③常规单克隆抗体：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞（杂交瘤）融合，成为增殖并产生大量抗体的干细胞。> ④ 第 1 步。通过引入诱变剂并改变碱基序列，创建了一个巨大的噬菌体库。
⑤ 第二步。筛选具有所需活性的噬菌体，然后确认核苷酸序列。
10.基因编辑
⑴ CRISPR-Cas9基因编辑技术
① 概述
○ 基因剪刀：细菌（例如大肠杆菌）中基因切割的机制，以消除病毒 DNA。
○ CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）
○ 源自感染原核细胞的噬菌体的 DNA 片段。
○ 存在于 50% 的细菌基因组和 90% 的古细菌基因组中。
○ CRISPR 阵列由重复的 DNA 序列和位于每个重复序列之间的间隔区组成。
○ 细菌或古细菌记录间隔区，即病毒等外部DNA的片段，并添加重复序列。
○ 随后，CRISPR-Cas9 系统检测并切割与间隔区匹配的病毒 DNA。
○ Cas9（CRISPR相关蛋白9）
○ 从化脓性链球菌等生物体获得。它有两个核酸酶结构域：HNH 和 RuVC9。
○ dCas9（核酸酶缺陷型 Cas9、死亡 Cas9）：无法切割 DNA，但能够通过 sgRNA 与 DNA 结合。
② 步骤1. CRISPR处理：下面描述嗜盐芽孢杆菌中I-C/Dvulg Cas5d亚型系统的CRISPR处理。
○ 第一第一。 Cas5d 识别 CRISPR 重复区域中的发夹结构和 3’ 单链序列，将 pre-crRNA 切割成单位长度的片段。
○ 第二第二。 Pre-crRNA 加工：将 pre-crRNA 进一步加工成更小的 crRNA。
○ 第三第。 Cas5d 与 crRNA、Csd1 和 Csd2 蛋白形成复合物。
○ 第 4。该复合物中的 crRNA 部分可检测并去除病毒 DNA。
图 9. CRISPR 处理
③ 步骤2. 与外部核酸的反应
○ 第一第一。 Cas9 在双链 DNA 中产生一个气泡，互补的 sgRNA（小引导 RNA）与该气泡内 PAM 位点旁边的目标 RNA 结合。
○ 该气泡称为 DNA 双链断裂 (DSB)。
○ sgRNA：病毒感染后幸存的细菌（例如大肠杆菌）基因组 DNA 中残留的病毒 DNA 片段。也称为间隔子或 gRNA（向导 RNA）。
○ PAM（Protospacer Adjacent Motif）位点：区分自身与非自身的 5’-NGG-3’ 核苷酸序列。
图 10. sgRNA 在 dsDNA 中的位置
○ 第二第二。 sgRNA-Cas9 复合物在同一位置切割模板 DNA、非模板 DNA 和 sgRNA。
○ 第三第。 Cas9 和 sgRNA 分离。
○ 第 4。形成气泡的 DNA 通过氢键重新退火。
○ 第五th。切割的模板和非模板 DNA 经历 DNA 修复机制。
○ 第 5th-1st。没有DNA修复机制的病毒会被CRISPR/Cas9机制消除。
○ 第五第-2第二。非同源末端连接 (NHEJ)：允许按照 Holliday 模型 连接完全不同的染色体。
○ 5第-3第。同源定向修复 (HDR)：发生特定碱基替换或添加重复序列等效应。
○ 第六th。在基因重组中，研究人员用有用的 DNA 取代 VNTR 基因中不必要的部分。
○ 利用同源定向修复机制。»> ○ 不仅可以应用于DNA，还可以应用于RNA、表观基因组和其他单核苷酸的编辑。
○ 基因编辑的类型：OE（过表达）、KD（敲低）。
④ 脱靶问题
○ 定义：将CRISPR/Cas9系统应用于基因治疗时，对靶基因以外的区域进行编辑的问题。
○ 化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 核酸酶因其高效而被广泛使用，但脱靶率较高。
○ 解决方案
○ 核酸酶突变
○ PAM 序列修改
○ gRNA 截短
图11. CRISPR/Cas9技术图
⑤ 应用领域
○ 用于信号转导研究目的：多重指导 RNA 可实现微扰筛选。
○ 用于成像研究目的。
○ 用于药物研究目的：研究特定基因受到抑制时药物摄取的变化。
○ 基因治疗：编辑导致罕见疾病的基因。
○ 时间测序（例如，Record-seq）。
⑵ 溶源病毒：基因治疗中主要使用的病毒是腺病毒和逆转录病毒。
⑶ siRNA、miRNA疗法：目前市场形势不佳
⑷ 核酸输送系统
① 概述
○ 在 COVID-19 大流行期间，Moderna 和辉瑞公司在商业上采用并取得了巨大成功。
○ 由于 mRNA 在体内不稳定，因此需要使用递送载体来确保其稳定性，直至到达目标组织或细胞。
② 1 型 mRNA 药物输送系统
○ 固体脂质纳米颗粒（SLN）：Moderna 和辉瑞采用的最流行的 mRNA 递送载体。
○ 80-100 nm 的单个 SLN 可以封装大约 100 个 mRNA 分子。
○ 例如：ALC-0315（辉瑞/BioNTech）、SM-102（Moderna）、ALC-0159（辉瑞/BioNTech）、PEG-DMG（Moderna）。
○ 阳离子脂质体
○ 聚合物和聚合物/脂质杂化颗粒
○ 胶束
○ 乳液
③ 2 型. DNA 药物输送系统
④ 3型. AAV（腺相关病毒）
○ 用作治疗阿尔茨海默病的制剂。
图 12. AAV 和 LNP 之间的比较
⑹ 巨型核酸酶
⑺ TALEN（转录激活剂样效应核酸酶）
⑻ ZFN（锌指核酸酶）
输入：2015.7.03 21:57
修改:2019.1.25 00:18