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第 10-2 章。表观基因组测序

推荐阅读：【生物学】第10章【基因组计划与测序技术】(https://jb243.github.io/pages/75)

1.类型1. 识别基因功能

2. 类型2. 识别转录调控

3. 类型3. 识别翻译后调节

4.类型 4. 可编程单元功能

a. 表观遗传学库

1.类型 1. 识别基因功能

⑴ 扰动序列

① 第一^第一。使用各种类型的 gRNA 文库处理表达 Cas9 的细胞。

○ 通过使用 CRISPR-Cas9，根据 gRNA 的类型，每个细胞中会发生各种扰动。

○ 过滤后至少应保留250万个细胞。

○ 每个扰动平均至少应有 100 个单元。

○ 每个单元应该有大约 10,000 个 UMI

② 第二^第二。使用同时检测 gRNA 和 mRNA 的测序技术（例如 scRNA-seq、MERFISH）

③ 第三^第。根据 gRNA 表达对细胞进行分组：细胞根据扰动条件自然分组。

④ 第 4。识别基因功能。

○ 前提：具有相似功能的基因很可能表现出相似的表达模式。

○ 可发现的结果 1. 由于扰动导致基因表达发生变化。

○ 可发现的结果 2. 由于遗传变异导致的扰动效应存在差异。

图 1. Perturb-seq 的总体示意图，包括验证实验

⑵ 体内扰动序列

① 第一^第一。将含有 Cre 的 AAV（腺相关病毒）递送给小鼠以诱导 Cas9 表达。

② 第二^第二。递送含有 sgRNA 的慢病毒。

③ 第三^第。在体内，CRISPR-Cas9 系统根据 gRNA 在每个表达 Cas9 的细胞中诱导各种扰动。

④ 第 4。大约 10 天后执行 scRNA-seq 和 MERFISH。

图 2. 体内 Perturb-seq 过程

2.类型 2. 识别转录调控

⑴ BS-seq（亚硫酸氢盐测序）

① 用亚硫酸氢盐处理以确定甲基化模式。

② 启用表观基因组分析。

③ 应用1. snmC-seq

○ 板基测序。

○ 测量 5-甲基- 和 5-羟甲基-胞嘧啶的总和。

○ 每个单元 1-2 百万次读取。

⑵ ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）

① 定义： 能够分析与特定蛋白质（例如转录因子）结合的 DNA 区域。

② 将 DNA 测序与 ChIP（染色质免疫沉淀）相结合，识别 DNA 相关蛋白的结合位点。

③ 第一^第一。用交联剂（例如甲醛）处理以固定蛋白质（例如转录因子）和 DNA。

④ 第二^第二。裂解细胞，仅留下 DNA/蛋白质复合物。

⑤ 第三^第。使用超声处理将 DNA 打碎成小片段 (200-350 bp)；交联的 DNA 保持完整。

⑥ 第 4。添加附着在磁珠上的抗体；施加磁场可以分离特定的蛋白质及其连接的 DNA。

⑦第五^th。反向交联：对沉淀物加热，将 DNA 与蛋白质分离。> ⑧ 第 6 名。进行测序以确定 DNA 序列。继续进行 PCR 扩增、片段大小选择、接头添加。

⑨ 第 7。将测序结果与基因组参考进行比较，以确定转录因子的结合位点等。

图 3. ChIP-seq 流程

⑩ 应用1. ChIP-chip：ChIP-chip的HTS版本是ChIP-seq。

⑪ 应用2. ChIP-PET

⑫ 应用 3. ChIA-PET：ChIP-seq 仅识别特定蛋白质的结合位置，而 ChIA-PET 研究结合 DNA 区域之间的相互作用。

⑬ 应用4. RIP-seq

⑭ 应用5. CLIP-seq

⑮ 应用6. meDIP-seq：DNA甲基化或羟甲基化。

⑯ 应用 7. ChIP-exo：使用 lambda 核酸外切酶消化。实验上很难。

⑰ 应用8. CUT&RUN（目标下切割并使用核酸酶释放）

○ 使用微球菌核酸酶 (MNase)。

⑱ 应用9. CUT&Tag（目标下的切割和标记）

○ 概述

○ Tn5 转座酶是一种酶，可切割 DNA 区域，产生各种片段，如单个核小体、二聚体、三聚体等。

○ Tn5 转座酶通过产生粘性末端来催化 DNA 插入。

○ 可以直接合并adapter，实现立即测序。

○ 程序

○ 步骤 1. 将细胞核与珠子结合以将其固定。磁捕获可实现细胞的高度保留。

○ 步骤 2. 添加一抗：数据质量高度依赖于抗体的质量（特异性和敏感性）。

○ 步骤 3. 添加二抗。

○ 步骤 4. 缀合 Tn5 转座酶与复合物结合并切割开放 DNA 的周围区域。

○ 步骤 5. PCR 扩增、片段大小选择、测序

○ 类型

○ MuLTI-Tag：通过直接条形码缀合最大限度地减少复用中的交叉。

○ 多切割和标签：使用带条形码的 Tn5/pA 抗体复合物。识别标记的共定位。

○ spatial-CUT&Tag：在空间上可视化组织切片上的组蛋白修饰和染色质状态。

表 1. CUT&Tag 与 CUT&RUN 与 ChIP-Seq（参考、参考、 参考，参考)

⑶ Hi-C seq（高通量染色质构象捕获测序）

① 定义：研究染色体上自然靠近的序列。

② 检查 DNA 距离以揭示细胞核内染色体的 3D 折叠结构。

图 4. Hi-C seq 流程

③ 应用1. ChIA-PET

○ 区别：Hi-C 研究所有自然发生的 DNA-DNA 相互作用，而 ChIA-PET 侧重于由特定蛋白质介导的 DNA-DNA 相互作用。

⑷ DNA 收报机磁带（prime 编辑）

① 第一^第一。最初，仅激活第一个站点。

② 第二^第二。第一个事件之后，第二个站点被激活。

③ 第三^第。随着时间的推移顺序记录分子事件。

⑸ ENGRAM（增强子驱动的多重转录活性基因组记录）

① 使用与合成增强子连接的 perRNA。

② 记录信号的顺序和强度。

③ 参考文献：Chen et al., bioRxiv (2021)

⑹ ATAC-seq（转座酶可及染色质测序分析）

① 概述

○ 定义：识别常染色质区域的测序技术。由于染色体是成对的，因此 ATAC-seq 中的每个信号可以具有 0、1 或 2 的值。

○ 假表达：常染色质区域可以推断为基因表达区域。

○ Tn5 转座酶是一种酶，可切割 DNA 区域，产生各种片段，如单个核小体、二聚体、三聚体等。

○ Tn5 转座酶通过产生粘性末端来催化 DNA 插入。

○ 可以直接合并adapter，实现立即测序。

○ 在 ATAC-seq 中观察到的 ~10.5 bp 周期性与 DNA 螺旋一整圈需要 10 bp 这一事实有关。

○ Tn5 中的第四个 α 螺旋充当主要的“识别螺旋”，并在 DNA 大沟中从位置 7 到 13 形成几个碱基对特异性接触。 (ref)

○ 与平均 B-DNA 相比，Tn5 转座酶使螺旋轴弯曲，导致滚动角和倾斜角增加，以及主沟和次沟宽度和深度的偏差。 （[参考]（https://raymentlab.biochem.wisc.edu/wp-content/uploads/sites/1624/2022/08/117rayment2000_davies.pdf））

○ 这可以解释 10.5 bp 的周期性，这与普通 B-DNA 中的 10 bp 周期性略有不同。

图 5. ATAC-seq 片段大小分布

② 类型 1. 批量 ATAC-seq

○ 步骤 1. 细胞核分离

○ 步骤 2. Tn5 转座酶处理：这会切割染色体中较少浓缩的开放区域并插入 DNA 序列标签。

○ 步骤 3. 扩增和测序

○ 步骤4. 数据分析

③ 类型 2. scATAC-seq

○ 定义细胞类型特异性 CRE，以识别与疾病和性状相关的调节性 TF 和细胞类型。

○ 用于解释 GWAS 变异。

○ scRNA-seq 和 scATAC-seq 的比较

○ scRNA-seq: x_ij ∈ ℤ_≥0

○ scATAC-seq: x_ij ∈ {0, 1}, j ≫ i

④ 类型 3. 空间 ATAC-seq

⑤ 类型 4. FAIRE-seq：甲醛交联染色质，苯酚-氯仿提取剪切 DNA。

⑥ 类型 5. DNaseI-seq：用于消化染色质的 DNase I 核酸内切酶。可以识别与染色质相互作用的转录因子的类型。

图 6. DNAseI-seq 结果示例

⑦ 类型 6. MNase-seq：内切核酸外切酶，持续消化 DNA 直至阻塞。

图 7. ATAC-seq 与各种测序技术的比较

⑺ NOMe-seq（核小体占据和甲基化组测序）> ① 同时测量 DNA 甲基化和核小体占据。

② 定义 TF 结合的核小体耗尽区域 (NDR)。

③ 识别与染色质相互作用的转录因子。

⑻ MBD-seq

⑼ Bru-seq（溴尿苷测序）& BruChase-seq

① 新转录的新生RNA用Bru（溴尿苷）标记，然后测序。

② 用于研究RNA合成、RNA稳定性和剪接。

③ 第一^第一。 Label nascent RNA in cells with bromouridine

④ 第二^第二。分离 Bru-RNA

⑤ 第三^第。从分离的 Bru-RNA 中制备 cDNA 文库并进行深度测序

⑽ TT-seq(transient transcriptome sequencing)

① 第一^第一。 Incorporation of 4-thiouridine into nascent RNA

② 第二^第二。分离标记的 RNA

③ 第三^第。准备 cDNA 文库并进行深度测序

⑾ MNIST-seq：RNA甲基化对染色质的调控

⑿ GRO-seq(global run-on sequencing)

① 第一^第一。 Cell harvesting and permeabilization

② 第二^第二。核连续反应

③ 第三^第。 RNA extraction and BrU-labeled RNA is isolated

④ 第 4。 Fragmentation and library preparation

⒀ PRO-seq(precision run-on sequencing)

① 第一^第一。细胞收获和透化

② 第二^第二。生物素化 NTP 的核连续运行

③ 第三^第。 RNA extraction and streptavidin pulldown

④ 第 4。 3’ adapter ligation and library prep

3。类型 3. 识别翻译后调控

⑴核糖测序

① 核糖体保护的RNA测序，表明翻译活跃。

② scRibo-seq

○ 测量每个密码子的核糖体占用率。

○ 第一^第一。 FACS 和裂解。

○ 第二^第二。核酸酶足迹：MNase 核酸酶→失活→足迹释放。

○ 第三^第。创建小RNA文库：末端修复→3’连接→5’连接→cDNA合成→索引PCR。

⑵ STAMP-RBP

① 使用 scRNA-seq 鉴定 RNA 结合蛋白 (RBP)。

② 第一^第一。将 APOBEC 连接到 RBP。

③ 第二^第二。在 APOBEC 和 mRNA 结合的位点启用 C-U 编辑，用尿嘧啶 (U) 替换胞嘧啶 (C)。

④ 第三^第。 RNA测序

⑤ 第 4。 Use SAILOR to identify C-U editing sites.

⑥ 还可以使用长读长测序来识别异构体特异性结合谱。₩

4。 Type 4. Programmable cell function

⑴ 雷达

① 第一^第一。当目标转录物存在时，它会形成 dsRNA 结构，使 ADAR 能够诱导 A 到 C 编辑。

② 第二^第二。这种编辑会诱导细胞行为，例如 GFP 表达和 caspase 激活。

⑵ LADL（光激活动态循环）

① 光激活基因表达的例子。

输入：2022.01.10 00:03

Modified: 2023.01.28 23:12