第 38 章微生物学实验
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1. 划线板法
2. 革兰氏染色
3. 抗生素敏感性测试
4. 艾姆斯测试
5. 交叉喂养实验
6. 中断交配技术
a. 微生物检测和基因监测
1.划线板法（划线板）
⑴ 定义：用于分离单个菌落的方法
⑵ 程序
图。 1. 划线平板法程序
① 第一第一。火焰对接种环进行灭菌。
② 第二第二。将细菌收集到环上。
③ 第三第。接种平板。
④ 第 4。接种程序（条纹之间的火焰环）
⑤ 第 5。离散集落的形成
2. 革兰氏染色
⑴ 革兰氏染色：由革兰氏公司开发的染色技术
⑵ 革兰氏染色：结晶紫→番红O
① 第一第一。将细菌通过酒精灯火焰 2-3 次，将其热固定到载玻片上。
② 第二第二。用结晶紫染色剂淹没涂抹的样品并放置 20 秒。
○ 此时，所有单元格均呈现紫色。
○ 由于结晶紫是一种带有 (+) 电荷的碱性染料，因此它与革兰氏阳性菌的磷壁酸有很强的结合力。
③ 第三第。在装有蒸馏水的管子中短暂冲洗掉污渍，并除去任何残留的水分。
④ 第 4。用碘溶液 (I2–KI) 淹没涂片并静置 1 分钟。
○ 碘形成结晶紫-碘络合物，防止变色和脱色（作为媒染剂）。
⑤ 第 5。将载玻片浸入含有 95% EtOH 的管中以洗掉碘溶液，并将其移入和移出。
○ 只有革兰氏阳性菌保持紫色。
○ 在革兰氏阳性细菌中，酒精会使细胞壁收缩，将 I2-结晶紫复合物捕获在细胞质内。
⑥ 第六th。将载玻片浸入蒸馏水中轻轻冲洗，以停止脱色。
⑦7th。用番红淹没涂片并静置 1 分钟。
○ 革兰氏阳性菌保持紫色。
○ 革兰氏阴性细菌吸收番红素并呈现红色。
⑧ 第 8。用水仔细冲洗几秒钟，然后除去水分。
⑶革兰氏阳性菌
①结构：原生质→细胞膜→厚肽聚糖层。
② 肽聚糖：由β 1→4 键交替连接的N-乙酰氨基葡萄糖（N-AG）和N-乙酰胞壁酸（N-AM）。
③ 形成内生孢子，具有耐高温、耐高压的能力。
④ 突出于肽聚糖之外的磷壁酸是共价连接的，并且仅在革兰氏阳性菌中观察到。
○ 磷壁酸含有谷氨酸，因此带有负电荷。
⑤ 示例： 枯草芽孢杆菌、炭疽杆菌、葡萄球菌。
⑷ 革兰氏阴性菌
①结构：原生质→细胞膜→周质空间→薄肽聚糖→周质空间→LPS、外膜。
② LPS（脂多糖）：有毒，是免疫系统的目标。
○ 肉毒杆菌的毒性也归因于LPS。
○ 青霉素不能通过LPS。
○ 引起血液凝固和高烧。> ③ 外膜：含有孔蛋白，比细胞膜的通透性更强。
④ 周质空间：
○ 将肽聚糖层与细胞膜和外膜分开的隔室。
○ 对于新陈代谢和运输等功能很重要的细胞空间。
⑤ 示例： 大肠杆菌、幽门螺杆菌。
3.抗生素敏感性测试 (AST)
⑴ 概述
① CFU（菌落形成单位）：样品中细菌或真菌孢子形成的菌落数
○ 必要时可使用公式：样品的CFU = 稀释样品的CFU × 稀释倍数
② MIC（最低抑菌浓度）：抗生素抑制微生物生长的最低浓度
③ MBC（最低杀菌浓度）：在营养培养基上继代培养后也不出现微生物的最低浓度
○ 本质上是杀死细菌的最低浓度
○ MBC ≤ MIC
④ 可以提供有关细菌身份的信息
⑵ 肉汤稀释试验（肉汤微量稀释法）
① 第一第一。制备不同浓度的抗生素，然后添加相同 CFU 的微生物。
② 第二第二。 MIC测定：孵育过夜后，测定不出现可见浑浊时的最低抗生素浓度。
③ 第三第。 MBC测定：将每个样品传代到营养培养基上，并确定不产生菌落的最低抗生素浓度。
④ 一个限制是它依赖于光密度。
⑶ 圆盘扩散法
① 测量药物产生的抑菌圈直径。
② 遵循 EUCAST 指南。
⑷ epsilometer 测试（E-test）
① 通过在单板上产生抗生素浓度梯度，可以直接、方便地测量 MIC。
② 无法测量MBC。
⑸ SCMA（单细胞形态分析）
① 动机：在测定血液样本的 MIC 时，结果很大程度上取决于初始细菌浓度。
② 使用光学显微镜可以轻松测定 MIC。
4.艾姆斯测试
⑴ 概述
①加州大学伯克利分校Bruce Ames博士团队开发的遗传毒性评估方法
② 用于鉴定致突变剂和致癌剂：与致癌性检测结果显示出很强的相关性；快速简单
③ 常用于药物开发一期前的筛选
④ 使用营养缺陷型突变验证是否发生回复突变
○ 回复突变：需要相同的突变机制，通常是点突变
⑤ 使用对诱变剂敏感的鼠伤寒沙门氏菌
⑥ 使用DNA修复功能正常的菌株时菌落减少
⑦ 常用测试菌株
○ 鼠伤寒沙门氏菌 TA98
○ 鼠伤寒沙门氏菌 TA100
○ 鼠伤寒沙门氏菌 TA1535
○ 鼠伤寒沙门氏菌 TA1537
○ 大肠杆菌 WP2 uvrA (pKM101)
⑵ 实验流程
① 准备S。鼠伤寒杆菌突变株（按菌株）。
② 准备固体基本培养基琼脂平板，将菌种铺展均匀。
③ 在每个板的中心放置一个浸有以下物质之一的圆盘：
○ 水：阴性对照
○ 肝酶：阴性对照
○ 化学：实验组
○ 水+肝酶：阴性对照
○ 化学物质 + 肝酶：如果菌落计数与仅使用化学物质的组相似，则该化学物质是直接诱变剂，即，它不需要在途径中进行代谢激活即可产生诱变。
④ 37℃孵育16小时。
⑤ 如果出现菌落，则它们是回复突变体，由于回复突变而失去了营养缺陷型的要求。
图 2. 艾姆斯测试结果示例
5.交叉喂养实验
⑴ 概述：确定代谢作用顺序的实验
⑵ 经营场所
① 突变体A的a基因有突变，B的b基因有突变，C的c基因有突变
○ 为了方便起见，我们将基因x产生的物质记为X
② 在无法合成脯氨酸的突变体中，脯氨酸生物合成的中间体在细胞内积累。
③ 积累的脯氨酸生物合成中间体通过琼脂培养基扩散。
⑶ 结果
① 22℃：A——仅部分菌株生长良好； B——所有菌株生长良好； C——没有菌株生长。
② 30℃：A——无菌株生长； B 和 C——所有菌株都生长良好。
③ 42℃：A——无菌株生长； B——只有部分菌株生长良好； C—所有菌株生长良好。
图3. 正常条件下的实验
图4. 温度依赖性评估实验
⑷ 解读
① 22℃下分析
○ C 物质的作用晚于 A 物质： ?? → A → C； A菌株之所以能存活，是因为它有酶c。
○ B 菌株是原养型（非营养缺陷型）。
② 30℃时
○ B 菌株是原养型的。
○ C 菌株是原养型的。
○ 鉴于上述（②）点，C 菌株不积累该物质；因此没有任何东西被转移到A菌株中。
③ 42℃时
○ B 株为营养缺陷型；它是一种温度敏感突变体。
○ 物质 A 的作用晚于物质 B: ?? → B → A； B菌株之所以能够存活，是因为它有酶a。
○ C 菌株是原养型的。
⑸ 解读技巧
① 酶在途径中作用越晚，突变越严重。
② 根据22℃实验，推断A→C。
③ 根据42℃实验，推断B→C。
6. 中断交配实验
图 5. 中断的交配实验过程
图 6. 中断交配实验结果
⑴ 第一名。 Hfr 菌株具有 strs leu+ thr+ azir tonr lac+ gal+
① 病症：抗生素敏感性、营养缺陷型
⑵ 第二第二。 F- 菌株具有 strr leu- thr- azis tons lac- gal-
① 条件：抗生素耐药性、营养需求
⑶ 第三第三。在含有链霉素且不含苏氨酸和亮氨酸的培养基中培养：只有含有 strr leu+ thr+ 的菌株才能存活
⑷第4次。交配8分钟后，azir另外存活：与strr leu+ thr+相邻，有azir
⑸第五th。交配 10 分钟后，tons 额外存活：与 strr leu+ thr+ azir 相邻，有 tons
⑹第六th。交配 16 分钟后，lac+ 额外存活：与 strr leu+ thr+ azir tons 相邻，有 lac+⑺7th。交配25分钟后，gal+另外存活：与strr leu+ thr+ azir tons lac+相邻，有gal+
⑻ 以此方式应用于遗传图谱的制作。
输入： 2019.03.17 16:28